系統仮説の評価を行う解析が PAUP よりも若干優れていると思います．SH-test，KH-test が行えて，log-difference と SE が出てくるので，log-difference/ SE を計算できます．このため，対立仮説が P=0.000 と完全に棄却された場合でも，他に P=0.000 となった仮説に比べて，どの程度強く棄却されたのかが理解できるようです (間違っていたら，ご指摘下さい)．PAUP では確か SE が出てこなかったと思います．読み込ませる系統樹は fully-resolved tree にする必要があるので，PAUP などで制約付きの解析を行って予め多分岐を含まない帰無仮説 (系統樹) を求めておく必要があります．

• outfile は自動的に上書きされてしまいます．解析が終了したら異なる名前にするなど，上書きされないように注意する必要があります．
  
  
• 現在 PAUP ではアミノ酸の解析は MP しか対応していませんが，PUZZLE では塩基とアミノ酸，両方の解析が可能です．
  
  
• SH-test などを行う際に，パラメーターを詳細に決定できます．PUZZLE (あるいは PAUP) で予め最尤樹のパラメーターを推定しておく必要があります．残念なのが，おそらく，SH-test を行う際に，毎回画面に表示される指示に従ってパラメーターを記入しなければならないことです (アミノ酸の場合など，amino acid frequency を 19 種類打ち込まなければならない)．ひょっとしたら infile に書き込むことが出来るかも知れないので，ご存じの方がいたら教えて下さい (上記のように Unix の Batch mode ではこの操作が可能なことがわかりました)．
  
  
• Mac のターミナルを使う場合は，ホームディレクトリーのファイルのみを読み込むので注意が必要です．マニュアルに従って PUZZLE をコンパイルすると，src にアプリケーションが作成されます．これをダブルクリックすることで自動的にターミナル上で PUZZLE が起動しますが，同じディレクトリーに infile を入れておいても駄目で，なぜかホームディレクトリーにデータと tree の infile を入れておく必要があります．どうも Win バージョンの方が完成度が高い気がします．
  
  
• 塩基配列の解析でパラメーターを入力する際，% で入力してください．最尤樹のパラメーターを求めた場合は，0.432 などのように % では表示されません．この誤りは outfile を見れば気がつきますが，入力の画面ではわかりません．アミノ酸の解析では，パラメータは % で求められるので，塩基の場合のような誤りは起きにくいです．
  
  
• RY 解析 (塩基配列の A と G を R，C と T を Y として Transversion だけを用いる解析) には対応していません．解析に際してそのサイトは無視されるようです．
  
  
• Windows で解析をする場合は，puzzle.exe をダブルクリックします．infile 名を聞かれるので答えると (もちろん tree file や sequence file は同じフォルダに入れておきます)，以下の画面が出ます (これは解析がスタートしていますが)．ここでは，SH test を行う準備段階として，樹形を選択して Bayes topology の最尤パラメータを推定しています．k を何度か選択して，画面のように「Evaluate user defined trees」にします．こうしておくと，解析をスタートされるために y を選択した後で，画面にあるように tree file 名を聞かれます．そして解析がスタートします．3500 残基，33 OTU で樹形固定の最尤パラメーター推定ですが，以下の画面のまま止まって，かなり時間がかかりました．2 時間弱でしょうか．Pinv と Gamma の shape parameters が outfile のどこに書いてあるのかわかりにくいですが，よく探すと書いてあります．